Sau quá trình tu học dài hạn, ngày 25 tháng 5 năm 1965, Phó tế Gioan Baotixita Phạm Minh Mẫn được thụ phong linh mục tại Cần Thơ,[4] bởi Giám mục Giacôbê Nguyễn Ngọc Quang.[8] Sau khi được truyền chức linh mục, Phạm Minh Mẫn được bổ nhiệm đảm trách vai trò giáo sư Tiểu chủng viện Cái Răng, Cần Thơ. Năm 1968, giám mục Giacôbê Nguyễn Ngọc Quang cử linh mục Mẫn đi du học tại Đại học Loyola, Los Angeles, Hoa Kỳ. Ba năm sau, Phạm Minh Mẫn tốt nghiệp với văn bằng phó Tiến sĩ về giáo dục và sau đó trở về nước tiếp tục làm giáo sư Tiểu chủng viện Cái Răng, Cần Thơ. Từ năm 1974, ông đảm trách vai trò Giám đốc Tiểu chủng viện Á Thánh Quý, Cái Răng, Cần Thơ và đến năm 1976 thì ông phụ trách việc đào tạo linh mục của giáo phận Cần Thơ.[4][9]

Năm 1988, Phạm Minh Mẫn được bổ nhiệm làm giám đốc tiên khởi của Đại chủng viện Thánh Quý – Cần Thơ, một đại chủng viện liên giáo phận nhằm đào tạo linh mục cho Giáo phận Cần Thơ, Giáo phận Vĩnh Long và Giáo phận Long Xuyên.[4] Trong thời gian này, ông giảng dạy cho các chủng sinh sống tinh thần đối thoại trong yêu thương, như Thiên Chúa yêu thương chúng ta. Trong khoảng thời gian cử đi giúp các xứ đạo khoảng một năm, các chủng sinh được khuyến khích tham gia hoặc có thể chủ động khai mở, vận động tổ chức các chương trình hỗ trợ người nghèo, đặc biệt là trẻ em của các gia đình khó khăn và người lớn tuổi không nơi nương tựa.[6]